Molecular cloning of a centrin homolog from Marsilea vestita and evidence for its translational control during spermiogenesis

Peter E. Hart and Stephen M. Wolniak

Abstract: Spermiogenesis in the water fern Marsilea vestita is a process that reaches completion 11 h after dry microspores are immersed in an aqueous medium at 20°C. Each microspore produces 32 spermatozoids and each spermatozoid has a coiled cell body and approximately 140 cilia. The spermatids make basal bodies de novo, from a structure known as a blepharoplast. From the onset of development, the spores contain a large quantity of protein and stored mRNA. We have found previously that centrin, a protein involved in the function of microtubule organizing centers and present in association with basal bodies in motile cells, is made in large quantity approximately 4 h after the microspores are placed into liquid medium. In this paper, we show that a centrin cDNA (MvCen1) we isolated from M. vestita closely resembles centrin cDNAs from other eukaryotic organisms. MvCen1, synthesized in Escherichia coli as a GST-fusion protein, reacted with anti-centrin monoclonal antibodies on immunoblots. Northern blot analysis demonstrates that centrin mRNA is present in the dry microspore at the time of imbibition, at levels that remain constant over 10 h of development and are unaffected by treatment of spores with alpha-amanitin. The centrin transcripts, stored in dry microspores, cannot be translated in vitro for at least 30 min after imbibition.

Key words: Marsilea vestita, spermatozoid, spermiogenesis, centrin, MTOC.

Résumé : La spermiogenèse chez Marsilea vestita, une fougère aquatique, est un processus qui se termine 11 h après l'immersion des microspores desséchées dans un milieu aqueux à 20°C. Chaque microspore produit 32 spermatozoïdes et chaque spermatozoïde a un corps cellulaire spiralé et environ 140 cils. Les corpuscules basaux des spermatides sont formés de novo à partir d'une structure nommée blépharoplaste. Dès le début du développement, les spores contiennent une grande quantité de protéines et d'ARNm. Antérieurement, nous avons montré que la centrine, une protéine jouant un rôle dans les centres organisateurs de microtubules et qui est associée aux corpuscules basaux des cellules mobiles, est synthétisée en grande quantité environ 4 h après l'immersion des microspores dans un milieu liquide. Dans cet article, nous montrons qu'un ADNc de la centrine (MvCen1), isolé de M. vestita, ressemble étroitement aux ADNc de la centrine d'autres eucaryotes. La MvCen1, synthétisée chez Escherichia coli sous forme de protéine fusionnée à la glutathion S-transférase, réagit avec des anticorps monoclonaux anti-centrine lors d'immunotransferts. Des transferts Northern montrent que l'ARNm de la centrine est présent dans la microspore desséchée au moment de l'imbibition, que sa concentration demeure constante durant 10 h de développement et qu'elle n'est pas modifiée en présence d'alpha-amanitine. Les transcrits de la centrine emmagasinés dans les microspores desséchées ne peuvent pas être traduits in vitro pendant au moins 30 min après l'imbibition.

Mots clés : Marsilea vestita, spermatozoïde, spermiogenèse, centrine, centre organisateur de microtubules, MTOC.

[Traduit par la Rédaction]