Can. J. Microbiol. 46(11): 1058–1065 (2000)  |  doi:10.1139/cjm-46-11-1058  |  © 2000 NRC Canada  

Use of lycorine and DAPI staining in Saccharomyces cerevisiae to differentiate between rho⁰ and rho^- cells in a cce1/Dcce1 nuclear background

Domenica Rita Massardo, Stephan G. Zweifel, Norio Gunge, Isamu Miyakawa, Nobundo Sando, Angelica Del Giudice, Klaus Wolf, and Luigi Del Giudice

Abstract: In the yeast Saccharomyces cerevisiae, mutants are viable with large deletions (rho^-), or even complete loss of the mitochondrial genome (rho⁰). One class of rho^- mutants, which is called hypersuppressive, is characterised by a high transmission of the mutated mitochondrial genome to the diploid progeny when mated to a wild-type (rho⁺) haploid. The nuclear gene CCE1 encodes a cruciform cutting endonuclease, which is located in the mitochondrion and is responsible for the highly biased transmission of the hypersuppressive rho^- genome. CCE1 is a Holliday junction specific endonuclease that resolves recombination intermediates in mitochondrial DNA. The cleavage activity shows a strong preference for cutting after a 5'-CT dinucleotide. In the absence of the CCE1 gene product, the mitochondrial genomes remain interconnected and have difficulty segregating to the daughter cells. As a consequence, there is an increase in the fraction of daughter cells that are rho⁰. In this paper we demonstrate the usefulness of lycorine, together with staining by 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), to assay for the mitotic stability of a variety of mitochondrial genomes. We have found that rho⁺ and rho^- strains that contain CT sequences produce a large fraction of rho⁰ progeny in the absence of CCE1 activity. Only those rho^- mitochondrial genomes lacking the CT recognition sequence are unaffected by the cce1 allele.

Key words: yeast, mitochondria, hypersuppressive, Saccharomyces cerevisiae, lycorine.

Résumé : Certains mutants de la levure Saccharomyces cerevisiae demeurent viables malgré des délétions importantes (rho^-) ou même après avoir perdu complètement leur génome mitochondrial (rho⁰). Une classe de mutants rho^- qualifiés d'hypersuppresseurs se caractérisent par leur capacité à transmettre fréquemment le génome mitochondrial muté à la progéniture diploïde suite à un accouplement avec une cellule haploïde (rho⁺) de type sauvage. Le gène CCE1 situé dans le noyau code une endonucléase qui coupe de façon cruciforme. L'enzyme est localisée dans la mitochondrie et semble responsable de la transmission fortement biaisée du génome rho^- hypersuppresseur. CCE1 est une endonucléase spécifique des jonctions Holliday qui détermine les intermédiaires de recombinaison dans l'ADN mitochondrial. Le clivage enzymatique se fait de façon fortement préférentielle après un 5'-CT dinucléotide. Comme conséquence, on observe une plus grande quantité de cellules-filles qui sont rho⁰. Dans le présent article, nous démontrons l'utilité de la lycorine en association avec une coloration par le 4',6-diamidino-2-ph nylindole (DAPI) pour mesurer la stabilité mitotique de divers génomes de mitochondries. Nous avons constaté que les souches rho⁺ et rho^- contenant des séquences CT avaient une progéniture fortement rhoo en absence d'activité CCE1. Les génomes mithocondriaux rho^- dépourvus de la séquence de reconnaissance CT étaient les seuls à ne pas être affectés par l'allèle cce1.

Mots clés : levure, mithocondrie, hypersuppresseur, Saccharomyces cerevesiae, lycorine.

[Traduit par la Rédaction]